Mesaj gönder
Bizimle iletişim kur
Selina

Telefon numarası : +86 13989889852

Naber : +8613989889852

Hücresiz DNA Kullanarak Transplantasyon Sonrası Katı Organların Sağlığının İzlenmesi

June 15, 2020

CFDNA temelli tanı doku biyopsisini geçersiz kılabilir
Costly and invasive tissue biopsies to detect allograft rejection after transplantation have numerous limitations. Transplantasyon sonrası allogreft reddini saptamak için pahalı ve invaziv doku biyopsilerinin sayısız kısıtlaması vardır. Assays based on cell-free DNA (cfDNA)—circulating fragments of DNA released from cells, tissues, and organs as they undergo natural cell death—have been intensively studied recently and could ultimately improve our ability to detect rejection, implement earlier changes in management, and even enhance the long-term survival of transplanted organs. Hücre içermeyen DNA'ya (cfDNA) (doğal hücre ölümüne maruz kaldıklarında hücrelerden, dokulardan ve organlardan salınan dolaşımdaki DNA parçaları) dayanan testler son zamanlarda yoğun bir şekilde incelenmiştir ve sonuçta reddi tespit etme, daha erken yönetim değişikliklerini uygulama yeteneğimizi geliştirebilir ve hatta nakledilen organların uzun süreli hayatta kalmasını arttırır.
CfDNA assays that circumvent the need for whole-genome sequencing (WGS) and the need for a priori knowledge of donor and/or recipient genotypes have powerful logistical advantages and are currently under clinical scrutiny. Tüm genom dizileme ihtiyacını (WGS) ve donör ve / veya alıcı genotiplerin a priori bilgisi ihtiyacını atlatan CfDNA analizleri güçlü lojistik avantajlara sahiptir ve şu anda klinik inceleme altındadır. In addition, improving knowledge of the organ-specific kinetics of donor-derived cfDNA (dd-cfDNA) following transplantation has also helped optimize these assays. Ek olarak, nakilden sonra donör türevli cfDNA'nın (dd-cfDNA) organa özgü kinetiği hakkındaki bilginin geliştirilmesi de bu analizlerin optimize edilmesine yardımcı olmuştur. Laboratories also have introduced alternative methods for quantifying dd-cfDNA, such as digital droplet polymerase chain reaction (PCR) and organ-specific DNA methylation patterns. Laboratuvarlar ayrıca dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve organa özgü DNA metilasyon kalıpları gibi dd-cfDNA'nın miktarını belirlemek için alternatif yöntemler de getirmiştir. As such, the field of minimally invasive diagnostics based upon cfDNA is increasingly promising, one day potentially replacing traditional tissue biopsies. Bu nedenle, cfDNA'ya dayanan minimal invaziv teşhis alanı, bir gün potansiyel olarak geleneksel doku biyopsilerinin yerini alan umut verici bir durumdur.
CFDNA'nın ORGAN REDDETİNDEKİ ROLÜ
Rejection, referring to injury of a donated organ caused by the recipient's immune system, can cause allograft dysfunction and even patient death. Alıcının bağışıklık sisteminin neden olduğu bağışlanan bir organın yaralanmasına atıfta bulunmak, allogreft işlev bozukluğuna ve hatta hastanın ölümüne neden olabilir. T-cell mediated acute cellular rejection (ACR) occurs most often within the first 6 months post-transplant (1). T-hücresi aracılı akut hücresel ret (ACR) çoğunlukla nakilden sonraki ilk 6 ay içinde görülür (1). ACR involves accumulation of CD4+ and CD8+ T-cells in the interstitial space of the allograft as the recipient's immune system recognizes antigens on the donated organ as foreign. ACR, alıcının bağışıklık sistemi bağışlanan organ üzerindeki antijenleri yabancı olarak tanıdığı için allogreftin interstisyel boşluğunda CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin birikmesini içerir. These T-cells initiate an immune cascade that ultimately leads to programmed cell death (apoptosis) of the targeted cells. Bu T hücreleri, sonuçta hedeflenen hücrelerin programlanmış hücre ölümüne (apoptoz) yol açan bir bağışıklık kaskadını başlatır. As these cells die, genomic DNA is cleaved and fragments of dd-cfDNA, measuring approximately 140 base pairs (bp) in length, are released to join the pool of recipient cfDNA in the blood and ultimately excreted in the urine (2). Bu hücreler öldükçe, genomik DNA parçalanır ve yaklaşık 140 baz çifti (bp) uzunluğunda olan dd-cfDNA fragmanları, kandaki alıcı cfDNA havuzuna katılmak üzere serbest bırakılır ve sonuçta idrarla atılır (2).
Circulating cfDNA has recently been leveraged as a diagnostic tool to replace invasive biopsies in other areas of medicine, including analyzing fetal DNA fragments within the maternal circulation to identify genetic abnormalities in utero and sequencing circulating DNA released from tumor cells to identify cancer-related mutations. Dolaşımdaki cfDNA son zamanlarda, uterodaki genetik anormallikleri tanımlamak ve kansere bağlı mutasyonları tanımlamak için tümör hücrelerinden salınan dolaşım DNA'sını sıralamak dahil olmak üzere maternal dolaşım içindeki fetal DNA fragmanlarını analiz etmek de dahil olmak üzere tıbbın diğer alanlarındaki invaziv biyopsilerin yerini almak için bir teşhis aracı olarak kullanılmıştır. In both these cases as well as in transplantation, high-throughput sequencing that identifies and quantifies DNA sequence differences distinguishes between the two different populations of cfDNA derived from distinct sources (2). Her iki durumda da transplantasyonda, DNA sekansı farklılıklarını tanımlayan ve ölçen yüksek verimli sekanslama, farklı kaynaklardan türetilen iki farklı cfDNA popülasyonu arasında ayrım yapar (2). Three characteristics of cfDNA make it an excellent noninvasive candidate biomarker to detect rejection after solid organ transplantation: It can be obtained from a simple blood draw, its concentration accurately measured, and its nucleotide sequence easily identified. CfDNA'nın üç özelliği, katı organ naklinden sonra reddetmeyi tespit etmeyi mükemmel bir noninvaziv aday biyobelirteç yapar: Basit bir kan alımından, konsantrasyonunun doğru bir şekilde ölçülmesinden ve nükleotit sekansından kolayca tanımlanabilir. Using cfDNA as a biomarker for ACR is also advantageous since it is derived from the injured cells of the donated organ and therefore should represent a direct measure of cell death occurring in the allograft. CfDNA'nın ACR için bir biyobelirteç olarak kullanılması da bağışlanan organın yaralı hücrelerinden türetildiği ve bu nedenle allogreftte meydana gelen hücre ölümünün doğrudan bir ölçüsünü temsil etmesi gerektiği için de avantajlıdır. Furthermore, cfDNA maintains all of the genetic features of the original genomic DNA, allowing the genetic material released from the donated organ to be differentiated from the cfDNA derived from cells of the recipient that are undergoing natural apoptosis (3). Ayrıca, cfDNA, orijinal genomik DNA'nın tüm genetik özelliklerini muhafaza ederek, bağışlanan organdan salınan genetik materyalin, alıcının doğal apoptoza maruz kalan hücrelerinden türetilen cfDNA'dan ayrılmasını sağlar (3).
Frequent and accurate monitoring of allograft health is essential for transplant recipients' long-term survival. Organ nakli alıcılarının uzun süreli hayatta kalması için allogreft sağlığının sık ve doğru izlenmesi esastır. For heart transplantation (HT), endomyocardial biopsy (EMB) is the current gold standard for detecting ACR (4). Kalp nakli için (HT), endomiyokardiyal biyopsi (EMB) ACR saptanması için mevcut altın standarttır (4). However, EMBs are costly with significant limitations, many of which are common to all organ biopsies (5-7). Bununla birlikte, EMB'ler, çoğu tüm organ biyopsilerinde ortak olan önemli sınırlamalarla maliyetlidir (5-7). Moreover, the invasive nature of EMBs puts HT patients at risk for complications (6,8,9). Ayrıca, EMB'lerin invaziv doğası HT hastalarını komplikasyon riski altına sokmaktadır (6,8,9).
Unfortunately, currently available noninvasive methods including echocardiography or magnetic resonance imaging (MRI) lack sufficient specificity and sensitivity to reliably detect rejection (10-13). Ne yazık ki, ekokardiyografi veya manyetik rezonans görüntüleme (MRI) dahil olmak üzere şu anda mevcut noninvaziv yöntemler reddinin güvenilir bir şekilde saptanması için yeterli özgüllük ve duyarlılığa sahip değildir (10-13). Blood-based biomarkers, such as cfDNA, represent a promising alternative that could be readily implemented into clinical practice (14-17). CfDNA gibi kan bazlı biyobelirteçler, klinik uygulamaya kolayca uygulanabilecek ümit verici bir alternatiftir (14-17).
MÜKEMMELLİK VE REDDET SIRASINDA CFDNA KİNETİĞİ
Since cfDNA originates from the naturally occurring process of apoptosis, all individuals have detectable levels of cfDNA in their blood (18). CfDNA doğal olarak oluşan apoptoz sürecinden kaynaklandığından, tüm bireylerin kanlarında saptanabilir seviyelerde cfDNA vardır (18). For healthy individuals, the majority of circulating cfDNA comes from hematopoietic cells that have undergone natural death related to cellular turnover. Sağlıklı bireyler için, dolaşımdaki cfDNA'nın çoğunluğu, hücresel ciro ile ilgili doğal ölüm geçiren hematopoietik hücrelerden gelir. Levels of cfDNA fluctuate for multiple reasons including infection, surgery, trauma, or even exhaustive exercise (2,19). CfDNA düzeyleri, enfeksiyon, cerrahi, travma ve hatta kapsamlı egzersiz de dahil olmak üzere birçok nedenden dolayı dalgalanır (2,19). Therefore, developing a cfDNA-based assay to detect rejection requires assessing the expected kinetics of dd-cfDNA release into the recipient's circulation post-transplant. Bu nedenle, reddini saptamak için cfDNA tabanlı bir tahlilin geliştirilmesi, nakil sonrası alıcının dolaşımına dd-cfDNA salımının beklenen kinetiklerinin değerlendirilmesini gerektirir. This consideration is especially important since the release of dd-cfDNA over time post-transplant is organ-specific (20-22). Transplant sonrası zaman içinde dd-cfDNA salınımı organa özgü olduğundan bu husus özellikle önemlidir (20-22).
For example, at 1 day post-HT the average level of dd-cfDNA is 3.8 ± 2.3% (20). Örneğin, HT sonrası 1 günde, dd-cfDNA'nın ortalama seviyesi% 3.8 ± 2.3'tür (20). However, by 7 days the level of dd-cfDNA has declined rapidly and remains consistently low (<1%). Bununla birlikte, 7 gün içinde dd-cfDNA seviyesi hızla düşmüştür ve sürekli olarak düşük kalmaktadır (<% 1). During an episode of acute rejection in the heart, the level of dd-cfDNA was found to increase to 4%–5% from a baseline of about 0.06% observed during quiescence. Kalpteki akut ret atağı sırasında, dd-cfDNA seviyesinin, durgunluk sırasında gözlenen yaklaşık% 0.06'lık bir taban çizgisinden% 4-5'e yükseldiği bulunmuştur. The kinetics of dd-cfDNA observed in the circulation of HT recipients was similar to that observed after renal transplantation (22). HT alıcılarının dolaşımında gözlenen dd-cfDNA kinetiği, böbrek nakli sonrası gözlenen kinetiklere benzerdi (22).
In contrast, recipients of bilateral lung transplants were found to have an average dd-cfDNA fraction of 26 ± 14% on the first postoperative day. Aksine, bilateral akciğer nakil alıcılarının postoperatif ilk gün ortalama dd-cfDNA fraksiyonunun% 26 ± 14 olduğu bulunmuştur. Furthermore, the reduction in dd-cfDNA was characterized by levels of dd-cfDNA that declined rapidly within the first week but then slowed and generally remained at 1%–3% (21). Ayrıca, dd-cfDNA'daki azalma, ilk hafta içinde hızla azalan ancak daha sonra yavaşlayan ve genellikle% 1–3'te kalan dd-cfDNA seviyeleri ile karakterize edildi (21). However, similar to heart and kidney transplants during an episode of acute rejection, the level of dd-cfDNA increased significantly, climbing to an average of 14%–15%. Bununla birlikte, akut red dönemindeki kalp ve böbrek nakillerine benzer şekilde, dd-cfDNA seviyesi önemli ölçüde artmış ve ortalama% 14–15'e çıkmıştır.
Differences in tissue mass and rates of cellular turnover account for this variability in the levels of dd-cfDNA released early post-transplant and during quiescence. Doku kütlesindeki farklılıklar ve hücresel ciro oranları, nakil sonrası ve sessizlik sırasında salınan dd-cfDNA seviyelerindeki bu değişkenliği açıklar. For example, differences in circulating dd-cfDNA levels in quiescent bilateral and single-lung transplants can be explained by the difference in cellular turnover, being 107 vs. 58 cells/second, respectively (21). Örneğin, hareketsiz bilateral ve tek akciğer transplantasyonlarında dolaşımdaki dd-cfDNA seviyelerindeki farklılıklar, sırasıyla 107/58 hücre / saniye olmak üzere, hücre devir sayısındaki farkla açıklanabilir (21). By contrast, in a quiescent transplanted heart, the cellular turnover rate is only 8 cells/second (21-23). Aksine, hareketsiz bir nakledilen kalpte, hücresel devir hızı sadece 8 hücre / saniyedir (21-23). Thus, an understanding of the expected levels of dd-cfDNA associated with a given solid organ is essential to facilitate development of organ-specific assays that detect rejection. Dolayısıyla, belirli bir katı organ ile ilişkili beklenen dd-cfDNA seviyelerinin anlaşılması, reddini tespit eden organa özgü testlerin geliştirilmesini kolaylaştırmak için gereklidir. Once the kinetics of cfDNA release for a particular organ are understood, several methods exist for quantifying the relative amount of dd-cfDNA. Belirli bir organ için cfDNA salımının kinetiği anlaşıldıktan sonra, göreceli dd-cfDNA miktarını ölçmek için çeşitli yöntemler mevcuttur.
STRATEGIES TO DISTINGUISH RECIPIENT- VS. ALICI MESAFEDE STRATEJİLER - VS. DONOR-DERIVED CFDNA BAĞIŞLI TÜREV CFDNA
Donör-Alıcı Cinsiyet Uyuşmazlığı
For organ transplants in which the donor is male and the recipient is female, laboratories can leverage this sex mismatch to calculate dd-cfDNA levels from within the recipient's total cfDNA pool (17). Vericinin erkek ve alıcının kadın olduğu organ nakilleri için laboratuvarlar, alıcının toplam cfDNA havuzundan dd-cfDNA seviyelerini hesaplamak için bu cinsiyet uyumsuzluğundan yararlanabilir (17). Researchers first demonstrated the feasibility of this approach in urine samples taken from female renal transplant recipients who had received a kidney from male donors and when they experienced rejection demonstrated elevated levels of dd-cfDNA in their urine that specifically contained regions found on the Y chromosome (17). Araştırmacılar ilk önce bu yaklaşımın, erkek donörlerden böbrek alan kadın böbrek nakli alıcılarından alınan idrar örneklerinde fizibilitesini gösterdiler ve ret yaşadıklarında, idrarlarında özellikle Y kromozomunda bulunan bölgeleri içeren yüksek dd-cfDNA seviyeleri gösterdiler ( 17). Although this approach allows for confident diagnosis of rejection in the allograft, sex-mismatch between the donor and recipient is relatively infrequent and not universally applicable. Her ne kadar bu yaklaşım allogreftte kendiliğinden reddetme teşhisine izin verse de, verici ve alıcı arasındaki cinsiyet uyuşmazlığı nispeten nadirdir ve evrensel olarak uygulanamaz.
Donör-Alıcı DNA Dizisi Farklılıkları
An organ transplant can also be regarded as a genome transplant, as the cells within a transplanted organ contain the genetic information of its donor. Bir organ nakli aynı zamanda bir genom nakli olarak da kabul edilebilir, çünkü nakledilen bir organ içindeki hücreler vericisinin genetik bilgilerini içerir. As such, the concept of genome transplant dynamics (GTD) relies on the presence of genetic differences between the donor and recipient at a particular locus, which then can be leveraged to identify the origin of the circulating cfDNA (20-24). Bu haliyle, genom nakli dinamiği (GTD) kavramı, verici ve alıcı arasında belirli bir lokasyonda, daha sonra dolaşan cfDNA'nın kökenini belirlemek için kullanılabilen genetik farklılıkların mevcudiyetine dayanmaktadır (20-24). Ideally, the recipient would be homozygous for a single base (for example, AA) and at the same locus the donor would be homozygous for a different base (for example, GG). İdeal olarak, alıcı tek bir baz (örneğin AA) için homozigot olacak ve aynı lokasyonda verici farklı bir baz (örneğin GG) için homozigot olacaktır.
Given the genetic heterogeneity between individuals, tens of thousands of potentially informative loci across the genome can be interrogated using high-throughput sequencing to distinguish dd-cfDNA from recipient cfDNA (20,24). Bireyler arasındaki genetik heterojenite göz önüne alındığında, genom boyunca on binlerce potansiyel olarak bilgilendirici lokus, dd-cfDNA'yı alıcı cfDNA'dan ayırt etmek için yüksek verimli sekans kullanılarak sorgulanabilir (20,24). This concept was first illustrated using banked samples from cardiac donors to obtain a priori donor genotypes for each donor-recipient pairing. Bu konsept ilk olarak her verici-alıcı eşleştirme için a priori donör genotipleri elde etmek için kardiyak donörlerden alınan bankalı örnekler kullanılarak gösterilmiştir. After extracting and sequencing cfDNA from each recipient, the fraction of donor-specific molecules was determined. Her bir alıcıdan cfDNA ekstrakte edildikten ve sıralandıktan sonra donöre spesifik moleküllerin fraksiyonu belirlendi. In samples taken during or immediately preceding a biopsy-proven rejection event, the proportion of donor-specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) was found to have increased from <1% to >3%–4% (24). Biyopsi ile kanıtlanmış bir ret olayı sırasında veya hemen öncesinde alınan örneklerde, donöre özgü tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP) oranının <% 1'den>% 3-4'e yükseldiği bulunmuştur (24).
This early retrospective study has now been validated prospectively. Bu erken retrospektif çalışma prospektif olarak doğrulanmıştır. Adult and pediatric heart and lung transplant recipients were recruited and genotypes for each donor-recipient pair were obtained through WGS with an average of 53,423 informative SNP markers identified (20). Yetişkin ve pediatrik kalp ve akciğer nakli alıcıları toplanmış ve her bir verici-alıcı çifti için genotipler ortalama 53.423 bilgilendirici SNP markörü ile WGS yoluyla elde edilmiştir (20). Overall, early detection of acute rejection was superior to that of AlloMap, the first Food and Drug Administration-approved non-invasive approach to detecting ACR after HT based on transcriptome analysis (25). Genel olarak, akut reddinin erken tespiti, transkriptom analizine göre HT sonrası ACR'nin saptanmasında ilk Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanan invaziv olmayan ilk yaklaşım olan AlloMap'tan daha üstündür (25).
Research also has shown that WGS not only provides information about a graft but also a patient's virome and overall state of immunosuppression. Araştırmalar ayrıca WGS'nin sadece bir greft hakkında değil, aynı zamanda hastanın virome ve immünosupresyonun genel durumu hakkında da bilgi verdiğini göstermiştir. This represents a potentially great advantage unobtainable by other assays (26-28). Bu, diğer tahliller tarafından elde edilemeyen potansiyel olarak büyük bir avantajı temsil eder (26-28).
However, WGS faces challenges that could prevent it from being implemented routinely in clinical practice. Bununla birlikte, WGS klinik uygulamada rutin olarak uygulanmasını engelleyebilecek zorluklarla karşı karşıyadır. For example, while a recipient's genetic information can be easily obtained, this is not always true for a donor. Örneğin, bir alıcının genetik bilgisi kolayca elde edilebilirken, bu bir bağışçı için her zaman doğru değildir. Moreover, WGS is costly, labor intensive, and time-consuming. Dahası, WGS maliyetli, emek yoğun ve zaman alıcıdır.
An alternative method employs a panel of genotyped polymorphic SNPs identified within the pool of extracted cfDNA thereby eliminating the need for a priori knowledge of a donor's specific genotype (29). Alternatif bir yöntem, ekstre edilen cfDNA havuzunda tanımlanan bir genotipli polimorfik SNP panelini kullanır, böylece donörün spesifik genotipi hakkında önceden bilgi sahibi olma ihtiyacını ortadan kaldırır (29). Unlike kidney and liver transplants, which often occur between closely related individuals, the donor-recipient pairs for heart and lung transplants typically are not related. Sıklıkla ilişkili kişiler arasında sıklıkla görülen böbrek ve karaciğer nakillerinin aksine, kalp ve akciğer nakilleri için donör-alıcı çiftleri tipik olarak ilişkili değildir. GTD requires genotyping of both the transplant recipient and donor. GTD, hem nakil alıcısının hem de vericinin genotiplenmesini gerektirir. However, in practice, donor genotype information is often unavailable. Bununla birlikte, uygulamada, donör genotip bilgisi genellikle mevcut değildir. Here, we address this issue by developing an algorithm that estimates dd-cfDNA levels in the absence of a donor genotype. Burada, bir donör genotipi yokluğunda dd-cfDNA seviyelerini tahmin eden bir algoritma geliştirerek bu sorunu ele alıyoruz. Our algorithm predicts heart and lung allograft rejection with an accuracy that is similar to conventional GTD. Algoritmamız, kalp ve akciğer allogreft reddini geleneksel GTD'ye benzer bir doğrulukla öngörür. We furthermore refined the algorithm to handle closely related recipients and donors, a scenario that is common in bone marrow and kidney transplantation. Ayrıca, yakından ilişkili alıcıları ve bağışçıları ele almak için algoritmayı, kemik iliği ve böbrek naklinde yaygın olan bir senaryoyu rafine ettik. We show that it is possible to estimate dd-cfDNA in bone marrow transplant patients who are unrelated or who are siblings of the donors, using a hidden Markov model. İlişkisiz veya donör kardeşleri olan kemik iliği nakli hastalarında gizli bir Markov modeli kullanarak dd-cfDNA'yı tahmin etmenin mümkün olduğunu gösteriyoruz. Therefore, algorithms have been developed for heart and lung transplants which assume that the donor's genotype occurs at the same frequency as the general population. Bu nedenle, donörün genotipinin genel popülasyonla aynı frekansta gerçekleştiğini varsayan kalp ve akciğer nakilleri için algoritmalar geliştirilmiştir. Based on these frequencies and comparison to the known genotype of the recipient, the fraction of dd-cfDNA can be reliably estimated from the total pool of cfDNA isolated from a recipient's plasma sample. Bu frekanslara ve alıcının bilinen genotipine kıyasla, dd-cfDNA'nın fraksiyonu, bir alıcının plazma numunesinden izole edilen toplam cfDNA havuzundan güvenilir bir şekilde tahmin edilebilir.
In the case of lung transplantation, this single-genome model, when compared to the methodology using both donor and recipient genotypes, was found to provide comparable fractions of dd-cfDNA. Akciğer nakli durumunda, bu tek-genom modelinin, hem donör hem de alıcı genotipleri kullanan metodoloji ile karşılaştırıldığında, dd-cfDNA'nın karşılaştırılabilir fraksiyonlarını sağladığı bulunmuştur. However, when researchers applied this same algorithm to HT, the estimated levels of dd-cfDNA were not as strongly correlated as in lung transplants. Bununla birlikte, araştırmacılar aynı algoritmayı HT'ye uyguladığında, dd-cfDNA'nın tahmini seviyeleri akciğer nakilleri ile güçlü bir şekilde ilişkili değildi. This might be related to the lower absolute amounts of dd-cfDNA present after HT. Bu, HT'den sonra mevcut olan daha düşük mutlak dd-cfDNA miktarlarıyla ilişkili olabilir. This is another example of organ-specific cfDNA kinetics that can influence assay results and must be taken into account (30). Bu, test sonuçlarını etkileyebilen ve dikkate alınması gereken organa özgü cfDNA kinetiklerinin başka bir örneğidir (30).
In the case of renal transplantation, prospective studies have been conducted to ascertain the utility of dd-cfDNA levels, identified using known donor-specific SNPs, as a viable marker for rejection. Renal transplantasyon durumunda, bilinen donöre özgü SNP'ler kullanılarak tanımlanmış dd-cfDNA düzeylerinin kullanımını reddetmek için uygulanabilir bir belirteç olarak tespit etmek için prospektif çalışmalar yapılmıştır. In one such study, 384 kidney recipients were recruited from 14 clinical sites to provide blood samples at scheduled intervals and at times of clinically indicated biopsies (31). Bu tür bir çalışmada, planlanan aralıklarla ve klinik olarak belirtilen biyopsilerin zamanlarında kan örnekleri sağlamak için 14 klinik bölgeden 384 böbrek alıcısı alınmıştır (31). Overall, the study focused on the correlation between the histology in 107 biopsy specimens from 102 patients and the levels of dd-cfDNA found in matched plasma samples. Genel olarak, çalışma 102 hastadan 107 biyopsi örneğinde histoloji ile eşleşen plazma örneklerinde bulunan dd-cfDNA seviyeleri arasındaki korelasyona odaklanmıştır. More specifically, 27 biopsy samples from 27 patients with active rejection were obtained along with 80 biopsy samples from 75 patients without active rejection. Daha spesifik olarak, aktif reddi olan 27 hastadan 27 biyopsi örneği ve aktif reddi olmayan 75 hastadan 80 biyopsi örneği alındı.
In this study, active rejection included acute antibody-mediated rejection (AMR), chronic AMR, and ACR. Bu çalışmada, aktif reddetme akut antikor aracılı reddetme (AMR), kronik AMR ve ACR'yi içermiştir. The assay used in this study employed a 1% cutoff for the fraction of dd-cfDNA to indicate the presence or absence of active rejection and was found to have 85% specificity (95% CI, 79%–91%) and 59% sensitivity (95% CI, 44%–74%). Bu çalışmada kullanılan deneyde, aktif reddin varlığını veya yokluğunu göstermek için dd-cfDNA fraksiyonu için% 1'lik bir kesim kullanıldı ve% 85 özgüllüğe (% 95 CI,% 79-91) ve% 59 duyarlılığa sahip olduğu bulundu (% 95 Cl,% 44-74). The sensitivity of this assay was greater for discriminating between active and absent AMR, as the use of a cutoff of 1% dd-cfDNA was found to have an 83% specificity (95% CI, 78%–89%) and 81% sensitivity (95% CI, 67%–100%). % 1 dd-cfDNA değerinin kesilmesinin kullanımının% 83 özgüllüğe (% 95 CI,% 78-89) ve% 81 duyarlılığa sahip olduğu tespit edildiğinden, bu testin duyarlılığı aktif ve yok AMR arasında ayrım yapmak için daha büyüktü. (% 95 Cl,% 67-% 100). Notably, in both cases, the sensitivity declined substantially when the fraction of dd-cfDNA exceeded 3%. Özellikle, her iki durumda da, dd-cfDNA fraksiyonu% 3'ü aştığında duyarlılık önemli ölçüde azalmıştır.
To improve specificity and sensitivity of a non-invasive cfDNA-based assay to detect rejection following renal transplantation, investigators also have surveyed the absolute amount of dd-cfDNA (32-33). Böbrek transplantasyonu sonrası reddi saptamak için noninvaziv bir cfDNA temelli testin özgüllüğünü ve duyarlılığını artırmak için, araştırmacılar ayrıca mutlak dd-cfDNA miktarını araştırmışlardır (32-33). By interrogating the absolute amount of dd-cfDNA, one can eliminate the artificial changes in the fraction of dd-cfDNA due to increases in total cfDNA levels caused by non-rejection events, such as infection, trauma, or exercise, potentially creating a more accurate assay. Dd-cfDNA'nın mutlak miktarını sorgulayarak, enfeksiyon, travma veya egzersiz gibi ret dışı olayların neden olduğu toplam cfDNA seviyelerindeki artışlardan dolayı dd-cfDNA fraksiyonundaki yapay değişiklikler ortadan kaldırılabilir ve potansiyel olarak daha fazla doğru analiz.
To investigate this possibility, one study employed 32 informative copy number variants (CNVs) based on population frequencies, as opposed to relative proportions of donor and recipient SNPs at given loci (32). Bu olasılığı araştırmak için, bir çalışmada, verilen lokustaki donör ve alıcı SNP'lerin nispi oranlarının aksine, popülasyon frekanslarına dayalı 32 bilgilendirici kopya sayısı varyantı (CNV) kullanılmıştır (32). All CNVs not present within a recipient's genome but present within the extracted cfDNA were therefore assumed to represent dd-cfDNA. Bu nedenle bir alıcının genomu içinde bulunmayan fakat ekstre edilen cfDNA içinde mevcut olan tüm CNV'lerin dd-cfDNA'yı temsil ettiği varsayılmıştır.
Interestingly, while the specificity and sensitivity improved overall with the use of absolute dd-cfDNA levels, this assay also had a greater capacity to distinguish between the presence and absence of active AMR, as opposed to cases of active ACR. İlginç bir şekilde, özgüllük ve duyarlılık mutlak dd-cfDNA seviyelerinin kullanımıyla birlikte genel olarak iyileşirken, bu test aktif ACR vakalarının aksine aktif AMR varlığını ve yokluğunu ayırt etmek için daha büyük bir kapasiteye sahipti. In addition, serum creatinine levels were not sufficient in discriminating between active rejection and quiescence, likely because it is more indicative of glomerular function as opposed to kidney tissue damage (31-33). Buna ek olarak, aktif kreatin ve sessizlik arasında ayrım yapmak için serum kreatinin düzeyleri, muhtemelen böbrek dokusu hasarının aksine glomerüler fonksiyonun daha fazla göstergesi olduğu için yeterli değildi (31-33).
Another study explored the absolute levels of dd-cfDNA in kidney transplant recipients related to levels of tacrolimus, an immunosuppressant (33). Başka bir çalışma, bir immünosüpresan olan takrolimus düzeyleri ile ilişkili böbrek nakli alıcılarında dd-cfDNA'nın mutlak seviyelerini araştırdı (33). Here, the researchers found that the absolute amount of dd-cfDNA was substantially higher in patients with lower tacrolimus levels (<8 μg/L) in comparison to those with higher drug levels. Burada araştırmacılar, daha düşük takrolimus düzeylerine (<8 μg / L) sahip hastalarda mutlak dd-cfDNA miktarının, daha yüksek ilaç düzeyine sahip olanlara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulmuşlardır. These data suggest that dd-cfDNA levels also have the potential to detect allograft injury resulting from inadequate immunosuppression. Bu veriler, dd-cfDNA seviyelerinin, yetersiz immünosupresyondan kaynaklanan allogreft hasarını saptama potansiyeline sahip olduğunu düşündürmektedir.
Laboratories also have proposed alternatives to WGS. Laboratuvarlar ayrıca WGS'ye alternatifler önerdiler. Our group explored targeted sequencing of 124 highly polymorphic (minor allele frequency [MAF] >0.4) SNPs using a commercially available panel, next-generation sequencing, and a novel algorithm (34). Grubumuz, ticari olarak temin edilebilen bir panel, yeni nesil sekanslama ve yeni bir algoritma kullanarak 124 yüksek düzeyde polimorfik (minör alel frekansı [MAF]> 0.4) SNP'nin hedeflenmiş sekanslamasını araştırdı (34). This approach significantly reduced the total amount of sequencing required, decreasing costs and assay time, and enabling rapid analysis. Bu yaklaşım, gereken toplam sekanslama miktarını önemli ölçüde azalttı, maliyetleri ve test süresini azalttı ve hızlı analiz sağladı. However, since this assay relies upon differences in MAF between individuals, it would not be robust for closely related donor–recipient pairs, such as seen in living-related kidney donation. Bununla birlikte, bu test bireyler arasındaki MAF farklılıklarına dayandığından, canlılarla ilişkili böbrek bağışında görüldüğü gibi yakından ilişkili donör-alıcı çiftleri için sağlam olmayacaktır. It remains to be validated for detecting moderate or greater rejection events. Orta veya daha büyük ret olaylarını tespit etmek için onaylanması gerekmektedir.
Laboratories also have explored using polymorphic SNPs to quantify dd-cfDNA combined with the technology of digital droplet PCR (30,35-37). Laboratuarlar ayrıca dd-cfDNA'yı sayısal damlacık PCR teknolojisi (30,35-37) ile birleştirmek için polimorfik SNP'leri kullanarak araştırdılar. Using 41 highly polymorphic SNPs, stable kidney and HT recipients showed dd-cfDNA fractions of 2%–3% with stable liver transplant recipients having a level of 7% (35). 41 yüksek düzeyde polimorfik SNP kullanarak, stabil böbrek ve HT alıcıları% 7 seviyesine sahip stabil karaciğer nakli alıcıları ile% 2-% 3 dd-cfDNA fraksiyonları gösterdi (35).
SONUÇLAR
The use of a costly and invasive tissue biopsy to detect allograft rejection has significant limitations. Allogreft reddini saptamak için pahalı ve invaziv bir doku biyopsisinin kullanılması önemli sınırlamalara sahiptir. As such, a minimally invasive assay that can directly and accurately assess the health of the entire transplanted organ represents a holy grail in solid organ transplantation. Bu nedenle, nakledilen tüm organın sağlığını doğrudan ve doğru bir şekilde değerlendirebilen minimal invaziv bir analiz, katı organ naklinde kutsal bir kâseyi temsil eder.
The use of cfDNA after transplantation has shown some initial promise, but further study and validation is required to improve our understanding of both the basic biology of cfDNA as well as its behavior post-transplant. Transplantasyondan sonra cfDNA kullanımı bazı başlangıç ​​vaatleri göstermiştir, ancak hem cfDNA'nın temel biyolojisi hem de transplant sonrası davranışı konusundaki anlayışımızı geliştirmek için daha fazla çalışma ve doğrulama gereklidir. At this time, it is clear that important organ-specific differences exist, and patterns of cfDNA release may also differ depending on the type of rejection event. Şu anda, organa özgü önemli farklılıkların olduğu açıktır ve cfDNA salım paternleri de ret olayının türüne bağlı olarak değişebilir. However, cfDNA represents one of the most promising technologies yet developed to complement or even ultimately replace the tissue biopsy. Bununla birlikte, cfDNA, doku biyopsisini tamamlamak veya hatta nihayetinde yerine koymak için henüz geliştirilmiş en umut verici teknolojilerden birini temsil eder.